头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）是一种由鳞状上皮覆盖且原发部位在口腔、咽喉部位的恶性肿瘤[1]。其发病较为隐匿，早期症状不明显，临床上超过60%的患者在确诊时已处于III期或IV期，这一阶段的患者常出现复发和转移，死亡率极高。相关的研究数据显示，HNSCC患者的中位生存期仅为10个月[2]。不仅如此，HNSCC因发病位置特殊，其原发部位、病理类型以及解剖关系的复杂程度在全身各处肿瘤中居于首位。此外，HNSCC对口腔颌面部器官的外观及功能损伤严重，给患者造成了极大的功能障碍，还会造成容貌破坏，极大影响了患者的生活质量。目前，HNSCC的治疗主要包括手术切除、放化疗以及免疫治疗。即便HNSCC的诊疗手段已经取得了很大的进步，但仍有50%左右的患者出现了不同程度的复发和远处转移，患者的5年存活率较低，仅为50%左右[3]。传统的手术及放化疗不仅存在一定的局限性，还往往容易导致术后颌面部功能损伤，以及放化疗带来的不良反应限制了治疗效果。鉴于HNSCC治疗现状，寻找更有效的治疗策略尤为迫切。

利用天然产物防治肿瘤在中国及其他亚洲国家已经有上千年历史，天然活性成分的抗肿瘤作用十分明显，显示出较高生物活性且不良反应轻微等优良特性[4-5]，近年来，从天然产物中寻找抗肿瘤活性成分，依然成为肿瘤治疗研究的热门方向[6]。蟾酥Bufonis Venenum是一种具有攻毒杀虫止痒功效的传统中药，临床实践表明蟾酥对多种肿瘤均有较好的抑制作用，但蟾酥毒副作用较强，服用方式不当或服用剂量不合适可能严重影响患者的身体健康。为了更加安全有效地利用蟾酥，我国科技工作者对蟾酥的有效成分进行了分离和研究，发现了蟾蜍它灵（bufotalin）、蟾毒灵（bufalin）、远华蟾蜍精（telocinobufagin）[7]等多种具有抗肿瘤活性的组分。蟾蜍它灵作为蟾酥中的一种类固醇内酯类的化合物，对恶性黑色素瘤、肝癌等多种恶性肿瘤具有良好的抑制作用[8]，但其对HNSCC的影响及作用机制还未见报道。因此，本研究考察蟾蜍它灵对HNSCC的影响及调控机制，为蟾酥作为抗肿瘤药物的进一步开发提供依据。

1 材料

1.1 细胞

人舌鳞癌Cal-27细胞（货号CL-0265）和人咽鳞癌FaDu细胞（货号CL-0083）均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 动物

1.3药品与试剂

1.4仪器

2方法

2.1细胞培养

Cal-27细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM完全培养基，FaDu细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的MEM完全培养基，于37℃、5% CO2的培养箱中培养，细胞贴壁生长至70%～80%融合状态时，进行后续实验。

2.2 给药溶液的制备

取蟾蜍它灵粉末1 mg，溶解于249.935 μLDMSO中，充分混匀后得到浓度为9 mmol/L的蟾蜍它灵母液，于−80 ℃避光保存。使用时，取出解冻，并用完全培养基稀释成相应浓度的给药溶液。

2.3 CCK-8法检测细胞活力

将生长状态良好的Cal-27与FaDu细胞，按4×103个/孔接种于96孔板中。培养过夜后，显微镜下确认细胞贴壁均匀且融合度适宜，再进行给药处理。设置对照组和蟾蜍它灵（22.5、45.0、90.0、180.0、360.0 nmol/L）组，对照组加入100 μL完全培养基，各给药组加入100 μL不同浓度的蟾蜍它灵溶液，作用24 h后，弃上清，加入100 μL按培养基-CCK-8试剂（20∶1）比例配制的工作液，37℃孵育1 h，在酶标仪450 nm测定吸光度（A）值，分析不同浓度药物下2种细胞的活力。

2.4克隆形成实验

取对数生长期的Cal-27与FaDu细胞，常规消化计数后，分别按2 000个/孔和500个/孔接种至12孔板，待细胞贴壁后，加入终浓度为22.5、45.0、90.0nmol/L的蟾蜍它灵处理24 h，对照组加入等体积的完全培养基，弃上清，更换为新鲜完全培养基继续培养7～14 d。待孔内出现较大但互不黏连的细胞团时，终止培养。吸去培养液，PBS清洗2次，用4%多聚甲醛于室温固定15 min，再以PBS清洗2次，随后每孔加入1%结晶紫染液1 mL，室温染色10 min。弃染液，用PBS冲净残色，将12孔板倒扣晾干后，观察集落形成数量及大小，并拍照记录。

2.5流式细胞术检测细胞周期分布

将处于对数生长期的Cal-27与FaDu细胞，消化处理后进行计数，调整细胞密度至2×105个/mL，接种于6孔板中。待细胞充分贴壁后，加入终浓度为22.5、45.0、90.0nmol/L的蟾蜍它灵处理24 h，对照组加入等体积的完全培养基。收集各组细胞，使用PBS清洗并重悬，再次离心后，以1 mL预冷70%乙醇重悬固定，4 ℃静置过夜。次日，用PBS洗去乙醇，200目筛网滤过后，用100 µLRNase A溶液重悬，37℃金属浴孵育30 min。随后加入400µL PI染色液混匀，4 ℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪在488 nm激发波长下检测细胞周期中的DNA含量变化。

2.6 Western blotting检测CDK4、cyclin D1、PERK、p-PERK、eIF2α和p-eIF2α蛋白表达

将对数生长期的Cal-27与FaDu细胞接种于10 cm培养皿中，细胞融合度达到70%时加入终浓度为22.5、45.0、90.0nmol/L的蟾蜍它灵处理24 h，对照组加入等体积的完全培养基。用预冷的PBS清洗2次，用细胞刮收集细胞于离心管中，加入含磷酸酶抑制剂及PMSF的RIPA裂解液，在冰上裂解提取总蛋白。使用BCA法测定蛋白浓度后，加入loading buffer于100℃加热10 min使蛋白变性。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶于室温封闭2 h；TBST洗膜3次，加入一抗，于4 ℃孵育12 h；TBST洗膜3次，加入二抗，于室温孵育30 min；TBST洗膜3次，加入显影液进行曝光显影，采用Image J软件测定条带灰度值。

2.7 蛋白质组学分析

2.7.1样品制备将Cal-27细胞经常规消化并计数后，以1×106个/皿接种于10 cm培养皿中。待细胞融合度达到70%时，加入终浓度为45 nmol/L的蟾蜍它灵处理24 h，对照组加入等体积的完全培养基。用预冷的PBS清洗2次，用细胞刮收集细胞于离心管中，用预冷的PBS清洗2次并尽量去除残留液体，离心后所得细胞沉淀于液氮中速冻10 min，随后转移至−80 ℃冰箱中保存备用。

2.7.2样品分析提取细胞蛋白并测定浓度后，依次进行蛋白质酶解、肽段除盐等步骤，随后采用非标记定量（Label-Free）策略对2组样本进行蛋白质组学分析。具体流程如下：建立蟾蜍它灵组与对照组的特异性蛋白数据库，并借助相关软件完成搜库；针对检测到的肽段与蛋白质信息实施质控筛选；结合京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路注释和基因本体（gene ontology，GO）功能注释对相关蛋白进行标注；开展蛋白质定量分析；基于定量结果筛选蟾蜍它灵组与对照组间的差异表达蛋白；对差异表达蛋白的生物学功能及亚细胞定位进行统计分析；对差异表达蛋白进行功能与通路富集分析；进一步应用IPA软件对关键差异表达蛋白进行深入通路解析。

2.8体内实验

2.8.1造模、分组与给药15只BALB/c裸鼠适应性喂养1周后进行荷瘤小鼠造模：在裸鼠侧腹sc 100 µLCal-27细胞（l×107个），接种后持续观察，待肿瘤体积接近100 mm3时，将裸鼠随机分为对照组和蟾蜍它灵低、高剂量（100、200 μg/kg）组，每组5只。各给药组ip蟾蜍它灵，对照组ip含0.1% DMSO的生理盐水，1次/d，连续给药16 d。每隔1 d用游标卡尺测量裸鼠瘤体的体积，并称量裸鼠体质量，绘制各组裸鼠肿瘤体积生长曲线以及体质量变化曲线。给药16 d后，所有裸鼠吸入异氟烷麻醉，眼眶取血后，断颈处死裸鼠，分离瘤体及组织用于后续实验。

2.8.2血清肝功能的检测血液于室温静置30 min使其充分凝固，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离血清，并转移到新的无菌EP管中，按照试剂盒说明书检测AST和ALT活性。

2.8.3 肝、肺、肾组织的苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色各组织于4%多聚甲醛固定24 h，流水冲洗后依次经过70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水各40 min；组织于二甲苯中透化，常规包埋，4 µm连续切片，60 ℃烤片1 h。将切片依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min以彻底脱蜡，随后经梯度乙醇（100%、95%、85%、70%）水化，用蒸馏水冲洗。苏木素染色30 s后流水清洗，1%盐酸乙醇分化，再次用流水冲洗，并用返蓝液反蓝1 min，伊红复染3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于倒置显微镜下观察并拍摄。

2.9 统计学分析

所有实验至少重复3次，数据以表示，使用SPSS 25.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析或t检验进行统计学差异比较。

3结果

3.1 蟾蜍它灵显著抑制Cal-27和FaDu细胞活性

为了研究蟾蜍它灵对Cal-27和FaDu细胞增殖的影响，以22.5、45.0、90.0、180.0、360.0 nmol/L梯度浓度的蟾蜍它灵分别处理上述2种细胞，培养24 h后采用CCK-8法检测细胞活力。结果如图1-A～C所示，经蟾蜍它灵处理后，细胞活力随药物浓度升高而显著降低（P＜0.01、0.001），蟾蜍它灵对Cal-27和FaDu细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）分别为52.02、136.20 nmol/L。鉴于两者IC50差异较大，后续实验以Cal-27细胞的IC50为参照，选取22.5、45.0、90.0 nmol/L作为蟾蜍它灵的给药浓度。随后，通过克隆形成实验评估蟾蜍它灵对Cal-27与FaDu细胞克隆能力的影响。结果如图1-D、E所示，与对照组比较，蟾蜍它灵各给药组克隆形成数量显著减少（P＜0.01、0.001），且呈浓度相关性，表明蟾蜍它灵能够抑制Cal-27和FaDu细胞的增殖。

3.2 蟾蜍它灵诱导Cal-27和FaDu细胞周期阻滞于G0/G1期

为了探究蟾蜍它灵抑制Cal-27和FaDu细胞增殖的机制，采用流式细胞术分析细胞周期分布。结果如图2-A、B所示，与对照组比较，蟾蜍它灵各给药组G0/G1期的Cal-27和FaDu细胞比例均明显上升（P＜0.05、0.001），而S期的Cal-27和FaDu细胞比例则显著减少（P＜0.05、0.001），表明蟾蜍它灵可以诱导Cal-27和FaDu细胞周期阻滞于G0/G1期。Western blotting结果显示，与对照组比较，蟾蜍它灵各给药组Cal-27细胞内CDK4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05，图2-C），而Cyclin D1蛋白表达水平无显著变化。由于细胞中CDK4和Cyclin D1是以复合物的形式协同发挥作用，因此，当只有CDK4的表达下调时，也能导致细胞出现周期阻滞。在FaDu细胞中，45.0、90.0 nmol/L蟾蜍它灵显著下调CDK4和Cyclin D1的蛋白表达（P＜0.05、0.001，图2-D）。以上结果表明，蟾蜍它灵可通过下调Cal-27和FaDu细胞内CDK4的表达，诱导细胞周期阻滞于G0/G1期。

3.3 蟾蜍它灵显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长

通过构建Cal-27细胞的异种移植瘤模型，进一步验证蟾蜍它灵的体内抗肿瘤活性。如图3-A～C所示，与对照组比较，蟾蜍它灵可显著抑制荷瘤小鼠体内肿瘤体积的增长（P＜0.01、0.001），但对荷瘤小鼠体质量无明显影响。本研究观察到蟾蜍它灵高剂量组的瘤体大小存在一定的组内差异，这可能与异种移植模型中肿瘤生长的个体异质性及对药物反应的敏感性不同有关。HE染色结果（图3-D）表明，给予蟾蜍它灵治疗后，肝、肺和肾这3个器官无明显形态变化，并且各组血清中AST和ALT活性无显著差异（图3-E、F），表明蟾蜍它灵对荷瘤裸鼠的肝、肺和肾组织无明显毒性，对肝功能无明显影响。

3.4蟾蜍它灵处理的Cal-27细胞中差异表达蛋白及富集功能分析

为了研究蟾蜍它灵抑制HNSCC细胞生长的分子机制，利用蛋白质质谱分析对蟾蜍它灵处理的Cal-27细胞内的差异表达蛋白进行筛选分析，通过使用差异倍数（fold change，FC）≥1.5或≤0.67，以及P＜0.05作为显著差异的阈值。如图4-A所示，在蟾蜍它灵处理的Cal-27细胞中，有1 261个显著差异表达蛋白，其中显著上调的蛋白有787个，显著下调的蛋白有474个。亚细胞定位与GO二级注释显示，在亚细胞层面，上述差异表达蛋白主要富集于细胞质与细胞核（图4-B）；从功能层面来看，主要集中于细胞过程、代谢过程、生物调节、蛋白复合体、细胞结合及催化活性等（图4-C）。

进一步富集分析结果显示，在细胞组分方面，上述差异表达蛋白在核糖体、核糖体前体、核糖体亚基、细胞器核糖体、蛋白酶体复合物等结构中存在显著富集（图4-D）；在生物学过程方面，显著富集于核糖体小亚基生物合成、细胞蛋白质合成分解、含蛋白质复合物的拆卸、核糖体生物发生、核糖体大亚基生物合成、细胞周期等过程（图4-E）；在分子功能方面，显著富集于翻译起始因子活性、翻译因子活性RNA结合、mRNA 5’-UTR结合、核糖体结合等功能（图4-F）。通过对差异表达蛋白的KEGG通路富集分析可知，上述差异表达蛋白与蛋白酶体、核糖体、帕金森病以及多种糖类和氨基酸的代谢等信号通路相关（图4-G）。分析显示有19个差异表达蛋白显著富集于细胞周期通路，提示细胞周期进程可能是蟾蜍它灵发挥抗肿瘤作用的信号通路之一。综上，蟾蜍它灵可能通过对细胞核糖体的功能、mRNA的翻译及氨基酸、多肽、蛋白质的合成代谢产生影响，进而发挥阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞生长的作用。

3.5蟾蜍它灵通过内质网应激-EIF2信号通路发挥抗肿瘤作用

为了进一步探究蟾蜍它灵抑制HNSCC细胞生长的分子机制，使用IPA软件分析蟾蜍它灵处理的Cal-27细胞内的差异表达蛋白，发现EIF2信号通路被显著激活（图5-A）。在EIF2信号通路中，其核心调控位点eIF2α的磷酸化是通路激活的关键标志，而PERK是促进eIF2α磷酸化的方式之一。因此，利用Western blotting检测Cal-27与FaDu细胞内eIF2α、PERK表达及其磷酸化水平的变化。如图5-B～E所示，与对照组比较，除蟾蜍它灵低剂量组p-eIF2α水平无明显变化外，各给药组p-PERK和p-eIF2α水平均显著升高（P＜0.05、0.001），而PERK和eIF2α的表达量无明显变化。以上结果表明，蟾蜍它灵可通过诱发Cal-27与FaDu细胞的内质网应激，促进PERK和eIF2α的磷酸化，从而使细胞周期阻滞于G0/G1期，发挥抗肿瘤作用。